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单细胞凝胶电泳标准操作

单细胞凝胶电泳标准操作

实验原理

在细胞核中,DNA是环状附着在核基质上,细胞裂解过程中,核基质被溶解、抽提,DNA的结构则未发生变化。如果DNA链上存在缺口,则使DNA超螺旋变的松弛,DNA环向外展,同时由于暴露了阴电荷,在电场力的作用下,松动的DNA环向阳极迁移,但是由于这种松动的DNA环一端仍附着于核DNA,其迁移距离受到限制,因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少。实际应当依靠尾长与尾部的荧光强度同时来进行分析。

实验步骤

1. 分离制备单细胞悬液:
   1) 体外培养的细胞株:用胰酶消化,吹打成单细胞悬液;
   2) 体内脏器细胞:处死动物,取出脏器,于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。
2. 胶板制备:
   1) 取20~50μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。
   2) 取100~150μl 0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上,再于其上加盖玻片,4℃冷凝10分钟。
   3) 取下盖片,取50~100μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与50~100μl细胞悬液(105个细胞/ml)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4℃冷凝10分钟。
   4) 去掉盖玻片,取70~100μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片,加盖玻片,4℃冷凝。
3. 细胞裂解与电泳:
   1) 将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,4℃裂解1小时。
   2) 取出胶板,放入电泳槽中,浸泡在电泳液中解旋20分钟。
   3) 4℃电泳20分钟(25V,300mA)。
4. 中和与染色:
   1) 电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次15分钟,共中和两次,注意更换中和液。
   2) 取出胶板,置于染色架上,滴加5μg/ml的PI,暗处染色20分钟。
   3) 蒸馏水脱色15分钟。
5. 镜检和分析:
   1) 在荧光显微镜下观察,绿光激发吸收滤片590nm。必要时照相记录。
   2) 记数观察的细胞,记录彗星细胞出现的频率,用目镜测微尺测头长与全长,计算核DNA迁移距离。

使用两层凝胶法,经裂解、DNA解旋、电泳和中和得到湿琼脂糖凝胶片。将湿琼脂糖凝胶片置于冰冷无水乙醇中脱水10分钟,后置于空气中自发干燥。全部操作在采血后8小时内完成,操作过程中注意避光。使用50µl 30µM的溴乙锭溶液染色、照相。使用单细胞凝胶电泳软件分析所有照片,随机测量100个以上细胞的尾长和olive尾矩,以尾长和olive尾矩的算术均数代表个体DNA损伤情况。

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