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免疫PCR注意事项

免疫PCR注意事项

免疫PCR注意事项实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法,因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合,因此要优化反应条件,以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子,又能结合上DNA。 
 
       此外,还可用化学方法将DNA与抗体分子共价偶联,即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的DNA分别用不同的双功能偶联剂激活,然后通过自发的反应偶联到一起,比如,用N-Succinimidyl-S-acetyl thioacetate(SATA)活化氨基修饰的DNA,用Sulfo-Succinimidyl 4-(maleimidomethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修饰抗体分子,然后将二者在一小管中混合,通过加入盐酸胲(Hydroxylamine hydrochloride)使二者偶联在一起。 
 
       免疫PCR具有高敏感性。因此,抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了,亦可在zui后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外,应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂,用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染,这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真,重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。  
  
       免疫PCR的一个优点是标记DNA序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换,以避免由于污染造成的假阳性信号。 
       免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此,应用免疫PCR可在微观水平(单细胞)检测抗原,定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量,在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。 

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