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Caspase 3 活性测定(FIENA法)检测细胞凋亡

Caspase 3 活性测定(FIENA法)检测细胞凋亡
Caspase3 的激活在凋亡过程的细胞事件启动中起着重要作用,有证据表明,在蛋白酶级联切割过程中,Caspase 3处于核心位置。本法运用荧光酶联免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA)的原理, Caspase3激活后会作用于其特异的底物:乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酰胺(Ac-DEVD),如将Ac-DEVD与荧光素连接(Ac-DEVD-AFC),即会产生荧光裂解产物AFC,而且caspase3的活性与Ac-DEVD-AFC的分解量或自由荧光产生荧光的强弱成正比。本法可用于各种培养细胞凋亡诱导研究,而且灵敏度高,特异性强(特异性的抗caspase 3单克隆抗体),与其他已知的caspases无交叉反应。
材料与试剂
1. 20x包被缓冲液 ;
2. 20x抗caspase3抗体;
3. 封闭缓冲液;
4. 孵育缓冲液;
5. 100xDTT;
6. 20x底物Ac-DEVD-AFC;
7. AFC;
8. 阳性对照: 凋亡细胞U937细胞裂解液;
9. 微孔板。
操作步骤
1. 样品制备: 以适当方法诱导(如2x106 个细胞)凋亡(1-24小时)。诱导后,以冷PBS洗涤细胞并离心(300xg)5分钟,收集细胞。设置未经诱导的阴性对照;
2. 重悬细胞, 加入细胞裂解液与之作用,冰上1分钟。 待细胞裂解后可以于-20°c储存一周;或直接离心,室温1分钟,取细胞溶解液100μl用于测定;
3. 包板:用抗Caspase 3 抗体包被液包被微孔板,孵育37℃ 1小时或4℃过夜。 用封闭缓冲液于室温条件下作用30min,以封闭非特异性结合。弃去封闭缓冲液,并用孵育缓冲液洗三次;
4. 测定Caspase 3活性:将样本(细胞裂解液100μl、阴性对照、阳性对照)加至抗caspase 3 包被MTP的微孔中,37℃孵育1小时, 弃去未结合标本, 以孵育缓冲液于室温洗板3 次,每次1min。 加入新鲜配制的Caspase底物溶液, 37℃ 反应1~3小时; 然后进行荧光光度检测, 激发波长400nm, 发射波长为505nm。
结果判断
Caspase 3的活性与AC-DEVD-AFC的分解量或自由荧光产生荧光的强弱成正比。
注意事项
此法特异性高,可在106 细胞裂解物中检测出5%的凋亡细胞率。 然而,对特定样本中的检测下限则随凋亡过程的动力学,诱导凋亡的试剂,以及在细胞总数中受影响的细胞数而异。
 

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