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质粒小量提取试剂盒使用说明

质粒小量提取试剂盒使用说明

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是DNA重组的常用载体,在DNA重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。在质粒提取过程中,多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:共价闭合环状DNA(cccDNA)、质粒的两条链没有断裂、超螺旋开环DNA(ocDNA)、质粒的一条链断裂、松弛的环状分子线形DNA(lDNA): 质粒的两条链均断裂;线性分子质粒DNA的分子构型 。
质粒小量提取的方法:
1. 将3~5ml菌液13,000rpm离心30秒收集沉淀(菌体)。 如果用1.5ml或2ml离心管则需反复离心2~3次。 
2. 倒掉上清,将沉淀(菌体)完全悬浮于100μl悬 浮液(溶液I)中。上清要尽可能去除干净,可用滤纸吸干。沉淀要 用混旋器完全悬浮,否则将直接导致下一步的裂 解不彻底,进而影响质粒DNA的产量和纯度。 
3. 加入150μl裂解液(溶液II),轻柔地颠倒混匀10 次左右,溶液逐渐变得粘稠、清亮。不可用混旋器剧烈振荡,否则会使质粒DNA断裂; 裂解时间不宜超过5分钟,否则会造成染色体DNA 的污染及质粒DNA的产率降低。 
4. 加入150μl中和液(溶液III),轻柔地颠倒混匀10 次左右。 此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。 
5. 13,000rpm离心8~10分钟,将上清液小心转入一 37个新的1.5ml离心管中,加入0.4ml纯化树脂(使 用前充分混匀),颠倒混匀3分钟。此步是通过离心去除染色体DNA及细菌碎片,并使处于高盐状态下的质粒DNA与纯化树脂结合。 
6. 将纯化树脂及上清液的混合物吸入离心纯化柱中,13.000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液。 
7. 将离心纯化柱重新套入废液收集管中,加入600μl 80%异丙醇(或80%乙醇),13.000rpm离心1分 钟,倒掉收集管中的废液。 如果离心纯化柱底部残留有异丙醇(或乙醇),可 用滤纸吸干,否则将影响以后的酶促反应。此步 是洗涤质粒DNA中混有的杂质及盐类。 
8. 重复第7步1~2次,尽可能将杂质去除。 
9. 取出离心纯化柱,将其套入一个干净的1.5ml离 心管,开盖放置2~3分钟,将残留的异丙醇(或乙 醇)挥发干净。加入50μl TE缓冲液(若用于测序, 则加50μl超纯水)于纯化树脂上,不能粘在管壁 上。室温下放置3分钟后,13,000rpm离心1分钟。 此步是将纯化树脂上的DNA洗脱下来。如果对质粒DNA的需求量较大,则重复此步骤1~2次,这 样可以获得高产量的质粒DNA。TE缓冲液或无菌 超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心纯化柱放入离心管中,若盖不上盖子,亦没有关系,可开盖离心。 
10. 离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒 DNA,取1~2μl电泳(0.8%琼脂糖,120V,15~ 20分钟)检测其纯度并目测定量。 若发现有RNA 污染,可加入0.5μl RNase A (10mg/ml),37℃保温30分钟。此操作不影响其 后续实验。
质粒小量提取注意事项:
1、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即拧紧盖子。
2、洗脱缓冲液体积不应少于50ul,体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围),pH值低于7. 0会降低洗脱效率,DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。
3、如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,使用5-10ml过夜培养物,同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。
 

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