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肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定

肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定

一、原理

在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团,称之为集落。肿瘤细胞能无限繁殖,所以具有这种能力,而成熟分化的细胞则不能形成集落。HL一60细胞是一种急性早幼粒细胞白血病细胞,在体外无需加刺激因子,可在软琼脂培养基中形成集落。二甲基亚砜是一种细胞分化诱导剂,经二甲基亚砜处理后的HL一60细胞按粒系途径定向成熟分化,同时细胞的增殖力降低,几乎全部细胞丧失了软琼脂中形成集落的能力。因此,这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

二、操作

1.收集对数生长期的HL一60细胞,先按实验十三测定细胞活力,然后调整细胞浓度,制成300~1000活细胞/ml的细胞悬液。

2.取二个培养瓶每个瓶中加9ml调整好浓度的细胞悬液,然后各加入1ml 3%琼脂(已融化,在65℃水浴中放置),迅速加入,混匀。

3.用微量加样器吸140μl二甲基亚砜(MDSO),加到一个瓶中,充分混匀,为实验组,另一瓶不加DMSO,为空白对照组。

4.取一个16mm多孔培养板,每孔加1ml(35mm培养皿需加2ml)细胞琼脂悬液,勿有气泡,将实验组和对照组分两组加好,盖上盖并作好标记。

5.在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。

以上各步骤均在无菌条件下进行。

6.然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。

7.培养7~10天,肉眼观察并计数细胞集落。

三、结果

以肉眼可见的细胞团(含500个以上细胞)作为计数集落的标准。对照组HL一60细胞在含0.3%的软琼脂培养基中生长良好,每个孔中可见有多个集落形成,而实验组HL一60细胞因经二甲基亚砜诱导分化,细胞在软琼脂中的集落形成明显减少。

四、集落的计数和计算

集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔

集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100%

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