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ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力

ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力


[ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力] 实验试剂 1. 0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)2. 1%BSA3. HRP标记的抗M13噬菌体多抗 4. 2mol/L H2SO4 实验设备 1. 酶标板 2. 酶标仪 实验步骤 1. 将抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀释至10μg/ml;2. 对于要检测的每个克隆,至少包被2个孔,每孔用200μl稀释抗原。同时包被阴性对照抗原。此外,包被阳性 [目的抗原 亲和力 噬菌体抗体 ELISA 抗原 噬菌体 包被]

实验试剂

1. 0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)

2. 1%BSA

3. HRP标记的抗M13噬菌体多抗

4. 2mol/L H2SO4

实验设备

1. 酶标板

2. 酶标仪

实验步骤

1. 将抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀释至10μg/ml;

2. 对于要检测的每个克隆,至少包被2个孔,每孔用200μl稀释抗原。同时包被阴性对照抗原。此外,包被阳性对照抗原,阳性对照抗原用anti-M13抗体;

3. 室温包被1~2h,于4℃过夜包被,甩掉孔中液体,倒置于纸巾上空干。

4. 每孔中用至少200μl 1%BSA封闭,37℃1h。去掉液体后空干。

5. 将重组噬菌体事先用等体积的封闭液于室温下封闭15min~30min,以封闭各种蛋白质之间的非特异性结合位点。

以M13噬菌体作为阳性对照噬菌体,也按上述步骤操作。

6. 在每个包被抗原孔中,加入稀释的重组噬菌体悬液200μl,37℃ 1~2h。在包被了阳性对照抗原的孔中,加入200μl阳性对照噬菌体。

7. 去掉孔中液体,倒置于纸巾上。将板浸入PBS/0.5% Tween20(PBST)中,振荡赶走气泡,将板取出。重复洗涤5遍。

8. 将板倒置于纸巾上,去掉所有液体。

9. 将HRP酶标的Anti-M13抗体用封闭缓冲液稀释至合适浓度。

10. 在每孔中加入200μl HRP/Anti-M13稀释液。

11. 37℃温育1h。按前述方法洗涤6次。

12. 每21ml 1×ABTS底物溶液中加入36μl 30% H2O2。在每孔中加入200μl。

13. 置室温20~60min,直至出现适中的颜色反应。加入2mol/L H2SO4终止反应。

14. 于415nm波长下用酶标仪读出光吸收值。良好的数据中,噬菌体抗体与筛选抗原的吸收值应当比阴性对照抗原的吸收值高2~3倍。

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