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ATCC细胞培养指南

   ATCC细胞培养指南
  为了确保活力,遗传稳定性和表型稳定,必须使细胞保持在对数期。这意味着细胞需要在进入平稳增长阶段之前,或在单层细胞长成100%融合之前,或在悬浮细胞达到推荐的最大细胞密度之前定期进行传代培养。为每个细胞系绘制生长曲线,对于测定该细胞系的生长特性是必要的。
  ~冻存细胞复苏~
  培养一个新的细胞时要特别注意培养基一致性的问题。虽然大多数细胞系可以在不止一种培养基中生长,但是当培养基改变时,细胞的性质也会变化。来自于不同厂家的培养基,即使名字相同或类似,配方也略有差异。仔细阅读说明书,配方,标签,确保使用正确的培养基。
  细胞复苏时,应以最快速度融化冻存的细胞溶液,然后迅速与完全培养基混合,并接种到合适的细胞瓶中。
  复苏程序
  1)准备细胞培养容器(如T-75细胞瓶),加入至少10 ml适当的培养基,并平衡温度及pH。
  2)从液氮罐中取出冻存管,并在37℃(或适合该细胞的温度)水浴中缓慢摇动至冰晶彻底融化(约2 min),注意解冻过程要迅速。
  3)从水浴中取出冻存管,浸泡或者喷撒酒精消毒。后续的操作,需在无菌操作台中,并保证严格无菌。
  4)拧开冻存管盖,将细胞悬液转移至含有9ml完全培养基的无菌离心管中。温和离心(125g×10min),弃去上清去除冻存保护剂。注意不要扰动细胞层。加入1-2 ml完全培养基重悬细胞,缓慢吹打使细胞团变松散。将细胞悬液转移至含培养基的容器中充分混合。
  5)24小时后,检测细胞状态。
  ~细胞传代培养~
  单层贴壁细胞的传代培养
  为了保证单层贴壁细胞的对数生长,需要定期传代。当细胞生长接近指数生长后期(汇合率大约70%到90%),准备传代。针对传代过程,ATCC提供的产品说明中,会推荐细胞传代分配比例和补充培养基策略。
  单层贴壁细胞传代,需要打断细胞之间的连接。对于比较松散的连接,猛击培养瓶侧壁,可以分离细胞。很多情况下,需要胰蛋白酶/EDTA的蛋白水解酶来消化。对于一些细胞系,需要采用刮等机械方法分离细胞。细胞分离成为单细胞悬液后,稀释到适当的密度并转移到新的培养瓶中,在适当的生长培养基中,细胞将再贴壁生长和分裂。
  由于每种细胞都是独特的,孵化时间和温度、清洗次数或溶液配方可能会有所不同。分离过程中,应用显微镜密切观察细胞,以防止细胞损伤。这个过程根据容器使用合适的培养体积。
  悬浮细胞的传代培养
  相对于单层贴壁细胞来说,悬浮细胞的传代更具有优势,单层贴壁细胞需要蛋白水解酶,会造成细胞损伤。而悬浮细胞可以使用稀释的方法来传代,细胞生长没有延迟,对实验室空间要求较小,传代培养是线性放大的。比如细胞可以在发酵罐中培养。
  据细胞类型,悬浮培养接种密度从2×10*4至5×10*5活细胞/ml。收获时细胞密度2×10*6细胞/ml。如果细胞接种密度过低,他们将经历增长延迟阶段,增长非常缓慢甚至完全死亡。如果细胞密度过高,细胞可能耗尽培养基中营养,而突然失效。
  ~细胞冻存~
  随着细胞被冷冻至冰点以下,悬液中冰晶和溶质的浓度有所增加。如果冷却过程中,胞内水分可以渗出细胞,则可以减少胞内冰晶。通常1℃/min的降温速度可以促进此过程。但是,水分的丧失会导致细胞收缩,当这种收缩达到一定程度,又会导致细胞活性的剧烈下降。冷冻保护剂,如甘油或者二甲基亚砜(DMSO),可以缓解这种效应。细胞冻存的标准程序是在含有冷冻保护剂的培养基中,将细胞缓慢冷冻至–70℃,然后将冻存管转移到液氮中以保持低于–130℃的环境。
  有很多方法可以实现1℃/min的降温速度。电脑控制的可编程电子降温系统的方式,可以精确保持降温速度。这也是ATCC采用的方法。但这种设备价格较高。比较经济的方式是将冻存管放置于冻存盒中,在低于–70℃的冰箱中冻存24小时。之后再转移至液氮长期储存。
  以下程序适用于大多数细胞。冻存培养基的配方请参考细胞说明书。冻存时,细胞应处于指数生长期。
  冻存程序
  1)冻存前先检测细胞是否受到细菌、真菌、支原体和病毒的污染。如果确定有污染,应将该细胞销毁。
  2)冻存培养基由完全培养基和5%DMSO组成。由于DMSO的溶解会放热,所以不能向细胞悬液中直接加入未稀释的DMSO。
  3)以温和速度(125g×10 min)离心收集细胞,并以1×10*6-5×10*6活细胞/ml的密度重悬细胞。
  4)在冻存管上标记好细胞名称,编号和冻存日期等信息。然后每管加入1-1.8 ml细胞悬液(视冻存管体积)并密封。
  5)室温条件下,将细胞在冻存培养基中平衡15-40 min(勿超)。这段时间中,可以将细胞悬液等分加入冻存管中。
  6)将冻存管置于已预冷至4℃的程序降温盒,之后置于-70℃(或更冷)的冰箱中至少24小时。或者使用已预冷至4℃的可编程电子降温系统。
  7)将冻存管迅速转移至液氮罐或者-130℃冰箱。
  8)记录冻存位置和过程细节等信息。
  9)24小时后,取出一只冻存管并复苏,以测定细胞活性和是否污染。

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