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PCR扩增产物的鉴定

PCR扩增产物的鉴定

实验原理

生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中.它们的净电荷取决于介质的H 浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中,带电颗粒向阴极或阳极迁移.迁移的方向取决于它们带电的符号.这种迁移现象即谓电泳。迁移的方式目前可以根据分子尺寸大小、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特性分为三类。如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中,使颗粒具有一定迁移速率的驱动力来自于颗粒的有效电荷Q和电位梯度E。它们与介质的摩擦阻力f抗衡:在自由溶液中,这种抗衡服从斯托克斯定律。f=6πrvη 这里v是在介质粘度为η半径为r的颗粒的移动速度。但在凝胶中,这种抗衡并不完全符合斯托克斯定律。f还取决于介质小的其他因子,如凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至介质的内渗率等。简言之电泳就是带电颗粒在电场中定向移动。
银染显色的原理是用甲醛将沉积在DNA带上的银离子(硝酸银)还原成金属银而显带。

实验试剂

1. 聚丙烯酰胺(C=30% T=5%):丙烯酰胺 28.5g 、 N,N’-二甲基双丙烯酰胺 1.5g、DDH2O 100ml;

2. 7%聚丙烯酰胺:30%聚丙烯酰胺 23.3ml、10ml 10×TBE溶液、66.7ml DDH2O;

3. 10×TBE溶液:Tris 113g 、硼酸 55g、 1000ml DDH2O;

4. 1×TBE溶液:10×TBE溶液100ml,900ml DDH2O;

5. 10%乙醇;

6. 0.1%硝酸;

7. 0.2%AgNO3

8. AgNO3 0.15g、DH2O 225ml;

9. 30%NaCO3-甲醛:NaCO3 30g、甲醛 0.85ml;

10. 0.1% AgNO3:AgNO3 1g、1000ml DH2O;

11. 上样缓冲液:0.25%二甲苯氰蓝、0.25%溴酚蓝;

12. TEMED;

13. 10%过硫酸胺:过硫酸胺1g、10ml DDH2O。

实验设备

1. 垂直电泳仪

2. 垂直电泳槽

3. 玻璃

4. 橡胶模框

5. 点样梳

6. 摇床

7. 微量进样器

8. 染色托盘

实验材料

PCR扩增产物

实验步骤

1. 电泳槽玻璃板的处理:用洗涤剂清洗玻璃板,自来水反复冲净洗涤剂,双蒸水冲洗3次,烘干,将两块玻璃装入恰当德橡胶模框内,并组装好电泳槽(带长玻璃的贮液槽为正极,带短玻璃的贮液槽为阴极)。
2. 制胶:加 35μl TEMED和300μl2.5%过硫酸胺至7%聚丙烯酰胺溶液中混匀。以60O角,缓慢注入两玻璃板间的空隙中,直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳,(小心勿使梳齿下带进气泡,并且不要将梳齿全部插入胶内,留约2mm梳齿于玻璃板上端,以免拔梳时把胶孔拔断)。由于凝胶在聚合过程中有回缩,所以应小心添加些胶液于梳子处,水平放置,室温聚合1小时。向电泳槽内灌入 1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳,用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
3. 加样:取2-4μl扩增产物和2μl上样缓冲液混匀,用微量进样器小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可适当增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
4. 电泳:电泳槽接上电极开启电源,根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小,决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l~5V/cm电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
5. 银染法显色:
   1) 方法一:

      a. 将PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min,用纯水洗一次;
      b. 0.1%硝酸3min,蒸馏水洗两次。
      c. 0.2% AgNO3溶液中10min,用去离子水洗三次;
      d. 用30% NaCO3-甲醛溶液显色至满意为止,用适量10%冰乙酸终止显色。
   2) 方法二:

      a. 取下凝胶,蒸馏水清洗凝胶30秒;

      b. 0.1% 硝酸银染色10分钟;

      c. 弃去染色液,蒸馏水洗胶两次;

      d. 显色液(显色液配方:10g NaOH 0.2g Na2CO2ml甲醛溶液,定溶到 500ml)显色至满意为止。
6. 分型:参照基因阶梯的电泳谱带进行分型。

注意事项

1. 每加完一个样品要清洗微量进样器,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
2. 以二甲苯氰蓝和溴酚蓝的位置大致判断泳动距离,7%聚丙烯酰胺非变性胶中溴酚蓝相当于170bp的泳动距离,二甲苯氰蓝相当于40bp的泳动距离。
3. 银染时显色液配制好在4-10 ℃预冷可以减轻胶板的底色,银染后胶板在水中漂洗时间控制在10s以内。

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