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供体细胞类型和基因型对小鼠体细胞克隆效率的影响

供体细胞类型和基因型对小鼠体细胞克隆效率的影响

实验步骤

1. 供体细胞准备

卵丘细胞从2-4月龄成熟母鼠获得,未成熟支持细胞从0-5日龄未成熟雄鼠获得。卵丘细胞通过透明质酸酶脱颗粒细胞获得。未成熟睾支持细胞获得方法如下:

取下的小鼠睾用0.1mg/ml胶原酶与0.01mg/ml脱氧核糖核酸酶37℃处理30min,然后用0.2mg/ml胰蛋白酶37℃处理5min,去睾悬液即可。睾悬液用含4mg/ml BSA的PBS洗一下就可用于显微注射了。未成熟睾细胞根据其体积与形态即可确认。

2. 受体卵母细胞的获得

8-10周龄BDF1雌鼠常规超排获得卵母细胞。7.5IU/只eCG,48h后7.5IU/只hCG。hCG注射后15h脱颈处死小鼠获得卵母细胞。(培养箱条件:37.5℃,6.2%CO2。)

3. 核移植

MII期受体卵母细胞在37℃条件下去核,操作液为含5µg/ml CB的Hepes-KSOM。BDF1染色体在Nomarski光学镜下能够很容易的辨认,利用Piezo装置将纺锤体及其周围少量胞质取出。去核的卵母细胞在KSOM液中孵育30min-2h使其胞膜完全恢复。供体细胞在室温下、Hepes-KSOM液中利用Piezo装置注入去核卵母细胞中。供体细胞的核没有必要从细胞质中完全弄出来,因为卵丘细胞与未成熟睾支持细胞的胞膜都是软的,在注射时它们的胞膜很容易破。注射了体细胞的卵母细胞在KSOM中孵育1-2h使体细胞的染色质凝集。重构胚在无Ca2、含3mM SrCl2 与5µg/ml CB的KSOM液中孵育1h,然后在含5µg/ml CB的KSOM液中孵育5h,zui后移入单纯的KSOM液中培养72h。

4. 胚胎移植

72h后发育到桑囊胚阶段的重构胚移植入8-12周龄假孕3d的ICR雌鼠(小鼠见栓当天称为*)子宫中。8-10枚胚胎移入一侧子宫(16-20枚胚胎移入一种受体小鼠)。在第20d时,检测受体小鼠中成活的胚胎,活着的小鼠让泌乳ICR雌鼠哺乳。

5. 试验设计与统计学分析

在试验1中,利用实验室小鼠品系检测供体细胞类型与基因型对看了胚胎发育的影响。在试验2中,检测了野生型基因型(JF1)与129基因型结合后的基因型克隆小鼠其发育能力是否比单纯的JF1克隆小鼠的发育能力强。

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