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流式细胞仪的原理简介

流式细胞仪的原理简介

流式细胞分析(flow cytometry,FCM)即流式细胞术,是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。它凝结众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。现代流式细胞术更是由于结合单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多领域研究中的应用有更加突飞猛进的发展。

 

一、流式细胞仪的原理

流式细胞仪主要由4部分组成:液流系统、光学系统、电子系统、分析系统。(如图1)它只能检测悬浮的单细胞或微粒的信号。

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图1 流式细胞仪组成结构                                           图2 流动室和液流驱动系统

 

一般是将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本,在一定气体压力下将待测样品压入流动室,用不含细胞或微粒的缓冲液(又称鞘液)在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度,使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动(如图2),形成一个圆形的流束(即鞘流),待测细胞在鞘流的包裹下单行排列,依次通过流式细胞仪的检测区域,经激发光激发后产生荧光信号。流式细胞仪通常以激光作为激发光源,经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光(如图3)。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测,称为前向散射(forward scatter,FSC),这种信号基本上反映细胞体积的大小;90°散射光又称侧向散射(side scatter,SSC),是指与激光束-液流平面垂直的散射光,其信号强度可反映细胞部分结构的信息。荧光信号的接收方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

 

计算机采集所测量到的各种信号进行计算处理,将分析结果显示在计算机屏幕上,也可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上,以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同而有多种形式可供选择——单参数数据以直方图的形式表达;对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维散点图、等高线图或三维的立体视图等。

 

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图3 光学系统                                                      图4 分选系统

 

流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选提取,它通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴上安装有超高频压电晶体,可以产生高频振荡,使液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷,当带电液滴通过电场,在电场的作用下发生偏转,然后落入相应的收集器之中,从而实现细胞分选(如图4)。

 

二、流式细胞仪的测量对象

1、大小:悬浮在溶液中的相互离散的颗粒,范围为0.2μm – 300μm。

2、类型:

细胞类型:1)高等真核细胞;2)酵母;3)细菌;4)多细胞的聚集体,如胰岛等。

非生命颗粒:细胞核、染色体、其他细胞器以及乳化微球等。

三、能够检测的细胞属性、组分(应用)

1、不需要染色

大小,胞浆颗粒度,细胞自发荧光,色素,细胞计数等。

2、需染色或标记

1)细胞膜:流动性,通透性,膜电位

2)细胞内离子:H+(可检测pH值),Na+,K+,Ca2+(结合的和自由的)

3)核酸:DNA含量,DNA成分,DNA合成,RNA,染色质结构等。

4)总蛋白质

5)蛋白质分子间相互作用

6)抗原

7)细胞骨架成分

8)受体

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