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教你如何正确选择二抗

通常情况下,某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择,如何能选择到该实验的二抗,需要综合以下几个方面进行考虑:

 

一抗的物种来源

 

一抗是在什么物种来源的,相应的二抗也要是抗该物种的抗体。例如,如果一抗是在小鼠体内制备的,那么你就应当选择抗小鼠的二抗,如果一抗是在兔体内制备的,那么二抗就应当是抗兔的抗体。至于二抗本身是在什么动物中制备的对二抗的质量并无明显的影响。

 

一抗是属于哪个类或亚类

 

二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体

 

单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品列表中列出,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM,或是抗小鼠IgG抗体。

 

如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1IgG2aIgG2bIgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。

 

如果你不知道一抗是哪一类别或亚类,那么抗小鼠IgG是一个不错的选择,因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

 

二抗的特异性

 

 

下面总结了几种具有不同特异性的二抗:针对整个抗体分子(HL)具有特异性:如抗IgG(H+L),此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合,即与抗体分子的FcF(ab)2/Fab部分(见图5)均可反应,抗IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应(如IgMIgA),因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链(kappa链或lambda链)。

 

针对Fab片段具有特异性:这类抗体与重链轻链均可以结合,由于它们可以与轻链反应,它们同时也已和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。

 

这对Fc片段或重链具有特异性:这类抗体和重链的Fc部分反应,一次它们是类别特异性的(即gamma链特异性抗体只与IgG反应,mu链特异性抗体只识别IgM,依此类推)。

 

轻链(kappalabmda)特异性:与所有类别的抗体反应,因为所有类别的抗体均具有相同的lambda链或kappa链。

 

经过吸附处理的二抗(cross-absorbed):不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构,抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应,一次有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理,以减少非特异性背景。例如,如果是小鼠的组织或细胞,那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合。但是此种抗体识别表位的数量被大大减少。

 

二抗的形式

 

选择哪种形式的二抗,是整个IgG分子,F(ab)2片段,还是Fab片段?

 

整个IgG分子:此种抗体适用于多数情况。

 

F(ab)2片段:该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成,这些抗体用在特定的情况中,如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。

 

Fab片段:它们只有一个结合位点,一般用来封闭内源性免疫球蛋白。

 

二抗的偶联标记

 

一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAPPAP),荧光基团(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blotELISA,zui常用的二抗是酶标二抗,而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用biotin/avidin检测系统。

 

下面简单介绍几种二抗探针的优缺点及其适用的实验:

 

酶:主要有两种不同的酶耦联物,HRPAP。比较而言,前者更经济、快速、稳定,而后者较前者更为灵敏,通常情况下,HRP广泛应用于免疫组化,western blot 和 ELISA 中,而碱性磷酸酶(AP)更适合于固相的免疫检测实验,如ELISAwestern blot.

 

荧光基团:

 

1.FITCFITC是广泛使用的荧光基团,但其zui大的缺点是淬灭快,使用抗淬灭剂可以减轻。

 

2.AMCA:常用在多标记实验中,如免疫荧光、流式细胞术。其缺点是,淬灭快,且由于肉眼不能很好的检测其所激发的蓝色荧光,因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。

 

3.花青染料(Cy2,Cy3,Cy5):Cy2FITC更稳定,且在表面荧光显微镜下,Cy2的荧光FITC更强。Cy3Cy5比大多数荧光基团更亮,更稳定,背景更弱。二者常在共聚焦显微实验中作多标记。但Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察,因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。

 

4.TRITC,RRX,TR:TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中,也可以使用RRXTR,但TR会产生较高的背景。在使用装有氪氢灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记实验时,RRX尤其有用,可以和Cy2(或FITC)及Cy5一起使用,因为RRX的发射波长在Cy2Cy5中间,且和这两者的重叠很少。

 

5.PE:常和FITC一起用于流式细胞术双标记实验。

 

6.生物素:生物素(biotin)可以和抗生素蛋白(avidin)发生不可逆反应而紧密结合在一起。首先加入生物素标记的二抗,在加入耦联有酶或荧光集团的avidinExtrAvidinstreptavidin,后者能够结合于二抗表面的多个位点上,从而极大的放大检测信号。

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